药物长期毒性试验

一、概述

不同药物的研发背景及已有研究资料各不相同。在开展长期毒性试验前，应综合分析受试物已有的研究资料，评估现有证据是否能够满足长期毒性评价的要求，为临床试验开展及临床安全用药提供科学依据。原则上，若现有资料尚不足以支持长期毒性评价，为保障临床试验受试者及未来临床用药安全，应开展长期毒性试验；反之，如已有资料能够满足评价要求，则可不再进行长期毒性试验。

长期毒性试验设计应建立在充分了解受试物特性的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。试验设计应综合考虑受试物的化学结构特点和理化性质、同类化合物的国内外临床应用情况、拟定临床适应证、目标用药人群、临床给药方案，以及已有的药效学、药代动力学和毒理学研究结果等因素，制定科学合理的评价方案。

二、长期毒性试验研究的基本内容

（一）受试物

长期毒性试验应采用制备工艺稳定、符合临床试验用质量标准要求的受试物。受试物应注明名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等信息，并附研制单位出具的自检报告。所用辅料、溶剂等应注明批号、规格及生产厂家，并符合试验要求。

（二）实验动物

1. 实验动物种属或品系的选择

一般化学药物长期毒性试验通常采用两种实验动物，一种为啮齿类动物，另一种为非啮齿类动物。理想的实验动物应具备以下特点：

（1）对受试物的生物转化特征与人体相近；
（2）对受试物较为敏感；
（3）具有丰富的历史对照数据。

鉴于目前国内研究现状，在多数长期毒性试验开始前，通常尚无法明确不同实验动物与人体在受试物生物转化方面的相似性，因此一般选择大鼠和Beagle犬或猴作为长期毒性试验动物。对于具有特殊结构的受试物，应选择适宜的特殊种属或品系动物开展长期毒性试验；必要时，也可采用疾病模型动物进行研究。鼓励在开展长期毒性试验前，采用体外试验体系筛选适宜的实验动物种属或品系。

2. 实验动物的质量控制

长期毒性试验一般选择正常、健康和未孕的动物，动物体重应控制在平均体重±20%范围内。实验动物应符合国家有关等级要求，来源、品系及遗传背景明确，并具有实验动物质量合格证明。动物年龄应根据研究周期及临床目标用药人群合理确定，同批动物的年龄应尽可能保持一致。一般大鼠为6～9周龄，Beagle犬为6～12月龄。

3. 实验动物的性别和数量

一般情况下，长期毒性试验各试验组应采用数量相等的雌、雄动物。每组动物数量应满足试验结果统计分析和安全性评价的要求。通常大鼠每组雌、雄各10～30只，Beagle犬或猴每组雌、雄各3～6只。

（三）给药方案

1. 给药剂量设计

长期毒性试验一般至少设高、中、低三个剂量给药组和一个溶媒（或辅料）对照组，必要时还需设立空白对照组或阳性对照组。因为理论上群体中毒性反应的发生率随暴露量的增加而增加，所以高剂量原则上应使动物产生明显的毒性反应，甚至出现个别动物死亡。低剂量原则上应高于动物药效学试验的等效剂量，并不使动物出现毒性反应。为考察毒性反应剂量-反应关系，应在高剂量和低剂量之间设立中剂量组。

2. 给药途径

给药途径原则上应与临床用药途径一致；如不一致，应该说明理由。

3. 给药频率

原则上，长期毒性试验应每日给药。对于给药期限较长（3个月及以上）的药物，每周给药次数一般不少于6天。对于特殊类型受试物，应结合其毒性特点及临床给药方案，合理设计给药频率。

4. 给药期限

长期毒性试验的给药期限通常根据拟定的临床疗程、适应证及目标用药人群确定。

对于临床单次给药药物，2周给药期限的长期毒性试验通常可支持其开展临床试验及后续上市申报。

对于临床疗程不超过2周的药物，1个月给药期限的长期毒性试验通常可支持其开展临床试验及后续上市申报。

对于临床疗程超过2周的药物，可在临床前一次完成支持III期临床试验（及上市申报）所需的长期毒性试验；也可根据研发进程，分别开展不同给药期限的长期毒性试验，以支持药物进入I期、II期和III期临床试验（及上市申报）。一般而言，1个月给药期限的长期毒性试验可支持开展用药时间不超过2周的I期临床试验。

通过给药期限较短的毒性研究获得的信息，可以为给药期限较长的毒性研究设计提供给药剂量、给药频率等方面的参考；同时，临床试验中获得的信息有助于给药期限较长的动物毒性研究方案的设计，降低药物开发的风险。

若采用不同给药期限的长期毒性试验分别支持药物进入I期、II期及III期临床试验（及生产），各阶段试验均应设计完整、实施规范，并对研究结果进行科学、合理的分析与评价。

（四）检测指标和检测时间

除必要的检测指标外，长期毒性试验还应根据受试物的特点增加相应的检测指标。

试验开始前，啮齿类动物至少应进行5天的适应性观察，非啮齿类动物至少应驯养观察1～2 周，观察内容包括实验动物的外观体征、行为活动、摄食量和体重等；非啮齿类动物还应至少完成2次体温、心电图、血液学和血液生化学指标等指标检测。此外，实验动物相关指标的历史背景数据也是长期毒性试验结果评价的重要参考。

试验期间，应持续观察动物的外观体征、行为活动、摄食量、体重、粪便性状、给药部位反应，以及血液学和血液生化学等指标。非啮齿类动物还应进行体温、心电图、眼科检查和尿液分析。应根据试验周期的长短和受试物的特点确定检测时间和检测次数。原则上应尽早发现毒性反应，并反映出观测指标或参数的变化与给药期限的关系。

给药结束后，应对动物（除恢复期观察动物）进行全面的大体解剖，主要脏器应称重并计算脏器系数。组织病理学检查对判断动物的毒性靶器官或靶组织具有重要的意义，病理学检查报告应经检查者签名和病理检查单位盖章，如发现有异常变化，应附有相应的组织病理学照片。非啮齿类动物对照组和各给药组主要脏器组织均应进行组织病理学检查；啮齿类动物对照组和高剂量给药组动物，以及尸检异常者应详细检查，如某一组织发生病理改变，其他剂量组动物该组织也应进行组织病理学检查。

长期毒性试验应在给药结束后对部分动物进行恢复期观察，以了解毒性反应的可逆程度和可能出现的延迟性毒性反应。应根据受试物的代谢动力学特点、靶器官或靶组织的毒性反应和恢复情况确定恢复期的长短。

（五）毒物代谢动力学

毒物代谢动力学（简称毒代动力学）系指结合长期毒性试验进行的考察药物系统暴露的代谢动力学研究。毒代动力学可以描述实验动物的系统暴露与暴露剂量、暴露时间和毒理学结果之间的关系。在本指导原则中，毒代动力学研究的主要目的在于解释长期毒性试验的结果。

毒代动力学试验应选择合适的时间点采样测定，从而获得药时曲线下面积（AUC ）、峰浓度（Cmax）、达峰时间（Tmax）等参数。某些药物应结合药物血浆蛋白结合率来评价系统暴露量。毒代动力学数据可以来自长期毒性试验的全部动物，也可以来自部分动物。建议此部分动物应包括低、中、高剂量组的动物，以便估算高剂量药物在动物体内的动力学过程是否属非线性动力学过程。

三、结果分析及评价

长期毒性试验的最终目的是预测人体可能发生的毒性反应。通过对研究结果进行科学分析与评价，可准确描述动物毒性反应的性质，并推断其与人体毒性反应的相关性。结果分析与评价是长期毒性试验的重要组成部分，应基于研究数据开展科学、全面的综合评价。

（一）研究结果的分析

分析长期毒性试验结果的目的是判断动物是否发生毒性反应，描述毒性反应的性质、程度（包括毒性起始时间、程度、持续时间以及可逆性等）和靶器官，确定安全范围，并探讨可能的毒性作用机制。

1. 正确理解试验数据的意义

在对长期毒性试验结果进行分析时，应正确理解均值数据和单个数据的意义。啮齿类动物长期毒性试验中组均值的意义通常大于单个动物数据的意义，实验室历史背景数据和文献数据可以为结果的分析提供参考。由于非啮齿类动物数量少、个体差异大，因此单个动物的试验数据往往具有重要的毒理学意义。此外，非啮齿类动物试验结果必须与给药前数据、对照组数据和实验室历史背景数据进行多重比较，文献数据参考价值有限。

在分析长期毒性试验结果时，应综合考虑数据的统计学意义和生物学意义。正确利用统计学假设检验有助于确定试验结果的生物学意义，但具有统计学意义并不一定代表具有生物学意义。在判断生物学意义时应考虑到参数变化的剂量-反应关系、其他相关参数的改变，以及与历史背景数据的比较。

此外，在对长期毒性试验结果进行分析时，应对异常数据进行合理的解释。

2. 正确判断毒性反应

给药组和对照组之间检测参数的差异可能来自于与受试物有关的毒性反应、动物对药物的适应性改变或正常的生理波动。在分析试验结果时，应关注参数变化的剂量－反应关系、组内动物的参数变化幅度和性别差异，同时综合考虑多项毒理学指标的检测结果，分析其中的关联和作用机制，以正确判断药物的毒性反应。单个参数的变化往往并不足以判断化合物是否引起毒性反应，可能需要进一步进行相关的研究。此外毒代动力学研究可以为毒性反应和毒性靶器官或靶组织的判断提供重要的参考依据。

（二）动物毒性反应对于临床试验的意义

深入开展毒性作用机制研究，有助于判断动物毒性反应与人体毒性反应之间的相关性。

（三）综合评价

长期毒性试验是药物非临床安全性研究的有机组成部分，是药物非临床毒理学研究中综合性最强、获得信息最多和对临床指导意义最大的一项毒理学研究。对其结果进行评价时，应结合受试物的药学特点，药效学、药代动力学和其他毒理学研究的结果，以及已取得的临床研究的结果，进行综合评价。对于长期毒性试验结果的评价最终应落实到受试物的临床不良反应、临床毒性靶器官或靶组织、安全范围、临床需重点检测的指标，以及必要的临床监护或解救措施。