蛋白纯化方法大全及优缺点比较

为什么蛋白纯化如此重要？

蛋白质的分离与纯化过程较为复杂。从细胞中提取的蛋白质，或通过沉淀、梯度离心、盐析等方法从蛋白质溶液中获得的蛋白质，通常仍含有一定杂质。为了去除这些杂质，同时保持蛋白质的生物学活性（如酶的催化活性），需要根据不同蛋白质的性质制定相应的纯化策略，并采用不同的分离纯化方法。电泳法和色谱法是较为常用的技术，其中色谱法对蛋白质作用较为温和，且能够大量制备具有生物学活性的高纯度蛋白质，因此已成为目前应用最广泛的分离纯化技术。

1、蛋白沉淀

蛋白质能溶于水是因为其表面分布有亲水性氨基酸残基。在蛋白质的等电点附近，若溶液离子强度特别低，蛋白质容易从溶液中析出；此外，通过加入高浓度盐使离子强度显著升高，也可导致蛋白质沉淀（盐析）。

硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离。但是在规模化生产上，硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题：硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。

除盐析外，蛋白质也可通过多聚物（如PEG、防冻剂）沉淀。PEG（聚乙二醇）是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。

蛋白沉淀对蛋白纯化而言并非理想方法，因为它通常只能达到几倍的纯化效果，而目标纯化往往需要上千倍的纯化倍数。其优势在于能将蛋白质从含有蛋白酶及其他有害杂质的培养基或细胞裂解物中分离出来。

2、缓冲液的更换

虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但其在蛋白纯化方案中仍具有重要作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH值及不同离子强度的缓冲液。若用硫酸铵将蛋白沉淀出来，蛋白无疑处于高盐环境中，需进行脱盐处理。可利用半透膜透析，通过频繁更换透析液去除盐分，但该方法耗时较长（通常需数小时至过夜），且难以用于大规模纯化

新型的设备将透析膜夹在两个板中间，在板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。

此外，市售脱盐柱也可用于此目的，柱内填料为小孔径颗粒，蛋白分子无法进入孔内，因而先于高浓度盐离子从柱中流出，实现二者分离

蛋白纯化的每一步都会导致目的蛋白丢失，缓冲液平衡的步骤尤为严重。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫以及离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。

3、离子交换色谱

离子交换层析是蛋白纯化中最有效的方法之一。基于蛋白质与离子交换树脂之间的静电相互作用，通过选择不同pH的缓冲液，同一种蛋白质既可以与阴离子交换树脂（结合带负电荷的分子）结合，也可以与阳离子交换树脂结合。树脂常用的功能基团有四种：二乙基氨基乙基（DEAE）用于弱阴离子交换树脂；羧甲基（CM）用于弱阳离子交换树脂；季铵（Q）用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯（S）用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸残基组成，其在不同pH环境下的净电荷不同。大多数蛋白在生理pH范围（pH 6～8）内带负电荷，因此需采用阴离子交换柱纯化；在极端pH条件下蛋白易变性失活，应尽量避免。

由于在特定pH下不同蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也存在差异，通过增加缓冲液中盐浓度或改变pH，蛋白可按结合力强弱依次被洗脱。在工业化生产中通常改变盐浓度而非pH值，因为前者更易于控制。在实验室中几乎总是采用盐浓度梯度洗脱离子交换柱，借助泵可使流入柱内的缓冲液盐浓度平稳上升，当离子强度足以屏蔽蛋白电荷时，蛋白即从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度难以精确控制，因此常用分步洗脱而非连续升高的盐浓度梯度。与排阻层析相比，离子交换层析选择性更好，有更多参数可调整以获得最优纯化效果，且树脂成本较低。

值得一提的是，即使在条件控制最精确的情况下，仅依靠单一的离子交换方法也无法获得纯蛋白，仍需结合其他纯化步骤。

4、亲和层析

亲和层析基于目的蛋白与固相化配基之间的特异性结合而使目的蛋白滞留，其他杂蛋白则直接流过柱子。本方法存在的问题是：单抗非常昂贵，且本身也需先纯化；单抗与目的蛋白结合力过强，需采用苛刻条件洗脱，这会导致目的蛋白失活并破坏单抗；混合物中的蛋白酶等杂蛋白也可能破坏抗体或与其非特异性结合；某些单抗还可能在纯化过程中从树脂上脱落并混入产物，这些脱落的抗体也需从终产物中去除。亲和柱通常在纯化过程的后期使用，此时样品体积已缩小，大部分杂质已经去除。

谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-transferase，GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有该标签的重组蛋白可用谷胱甘肽交联的层析介质纯化，但本方法存在以下缺点：首先，蛋白上的GST必须正确折叠，形成能与谷胱甘肽结合的空间结构，方可采用此方法纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性，易导致包涵体的形成，从而破坏蛋白的天然结构，难以进行结构分析，有时即便在纯化后酶切去除GST标签也不一定能解决问题。

另一种常用的亲和纯化标签是6组氨酸标签（His-tag），组氨酸的咪唑侧链可结合镍、锌、钴等金属离子，在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白可与镍柱结合，通过提高咪唑浓度进行竞争洗脱。与GST相比，组氨酸标签具有诸多优点：首先，由于仅有6个氨基酸，分子量很小，通常无需酶切去除；其次，可在变性条件下纯化蛋白，在高浓度尿素和盐酸胍中仍能保持结合力；另外，6组氨酸标签无免疫原性，重组蛋白可直接用于动物免疫，也不影响免疫学分析。

尽管His-tag具有上述优点，重组蛋白表达过程中仍可能出现目的蛋白形成包涵体、难以溶解、稳定性差及错误折叠等问题。此外，镍柱纯化也存在缺陷：金属镍离子容易脱落并混入蛋白溶液，不但可能通过氧化作用破坏目的蛋白的氨基酸侧链，而且柱子也会非特异性吸附蛋白质，影响纯化效果。除上述标签外，若目的蛋白可与某种碳水化合物特异性结合，或需要某种特殊辅因子，可将该碳水化合物或辅因子固相化制成亲和柱，结合后目的蛋白可用高浓度的碳水化合物或辅因子洗脱。

5、疏水作用

蛋白质由疏水性氨基酸和亲水性氨基酸组成。通常情况下，疏水性氨基酸位于蛋白质空间结构的内部，远离表面的水分子；而亲水性氨基酸残基则分布于蛋白表面。由于亲水性氨基酸能够吸引大量水分子，因此蛋白质分子通常被水化层包围，内部的疏水区域不会暴露于外界。

在高盐浓度条件下，蛋白质表面的水化层被削弱，疏水区域逐渐暴露，并与疏水介质表面的疏水性配基发生相互作用。不同蛋白质的疏水性程度不同，其与疏水配基之间的结合力也存在差异。通过逐渐降低缓冲液中的盐浓度，可以减弱蛋白与疏水配基之间的相互作用，使蛋白质恢复天然构象并从层析柱中洗脱下来。

疏水作用层析介质的选择性主要由疏水性配基的结构决定。常用的配基包括直链烷基配基（alkyl ligands）和芳香基配基（aryl ligands）等，一般情况下，配基链越长，其与蛋白的结合能力越强。理想介质的选择应根据目标蛋白的化学性质确定，不宜选择结合力过强的树脂，否则会导致蛋白难以洗脱。因此，在方法开发初期，通常先采用结合力适中的苯基树脂进行条件筛选。

为了便于筛选合适的介质，Amersham Biosciences推出了疏水作用层析树脂筛选试剂盒，其中包含5种不同类型的树脂供比较选择。疏水作用层析特别适合作为离子交换层析后的下一步纯化工艺，因为该技术需要在高盐条件下上样，而离子交换层析得到的样品通常可直接用于疏水层析，无需更换缓冲液。此外，蛋白质在低盐缓冲液中洗脱，也有利于减少后续纯化步骤中的缓冲液置换操作，从而节省时间并降低蛋白损失。

6、排阻层析

排阻层析（Size Exclusion Chromatography，SEC），又称凝胶过滤（Gel Filtration）或分子筛。排阻层析柱的填料为多孔介质，颗粒之间所能容纳的液体体积称为流动相体积，也称为无效体积。分子量较大的蛋白质无法进入填料颗粒的孔道，只能存在于颗粒间的流动相中，因此最先从柱中洗脱，这类蛋白几乎不发生分离作用。由于不同蛋白质分子大小不同，其进入特定孔径颗粒内部的能力也存在差异。分子量较大的蛋白质先被洗脱，而分子量较小的蛋白质则后洗脱。

为获得较好的分离效果，应选择孔径与目标蛋白分子大小相匹配的填料，使目标蛋白的洗脱体积接近无效体积与总柱床体积之间的中间区域。

排阻层析具有其他分离方法不具备的优点：首先，可分离的蛋白分子量范围较宽，例如Tosoh Biosep公司的聚合物树脂，其分离范围可达约200,000 kDa；其次，填料微孔结构适用于球形蛋白的分离，且整个纯化过程无需使用可能导致蛋白变性的有机溶剂。

需要注意的是，并非所有蛋白都适合采用凝胶过滤纯化，因为该类填料具有一定亲水性，带有较高电荷密度的蛋白可能发生非特异性吸附。

排阻层析通常不用于纯化流程的早期步骤，因为该方法要求样品高度浓缩，上样量一般仅为柱体积的1%～4%。此外，为获得良好分离效果通常需要较长且较细的色谱柱，同时填料成本较高，因此在大规模工业生产中应用受限。

7、电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）通常用于分析蛋白混合物样品的复杂程度以及监测蛋白纯化效果。该方法具有极高的分离分辨率，但由于随着凝胶厚度增加，电泳过程中产生的热效应会严重影响蛋白质迁移，因此很难在不降低分辨率的情况下放大至制备规模。

在基础研究中，有时仅需要少量高纯度蛋白用于后续实验，如蛋白质测序等，此时电泳纯化是一种简便而快速的方法。此外，聚丙烯酰胺凝胶电泳也是蛋白纯化过程中重要的分析手段，可用于检测目标蛋白在离子交换层析不同盐浓度洗脱组分中的分布情况，并用于评估纯化效果和蛋白纯度。

近年来，随着生命科学相关学科的迅速发展，对蛋白纯化技术的需求不断增加，传统纯化方法持续得到改进，同时也涌现出许多新型纯化技术。羟磷灰石是一种磷酸钙晶体材料，早期由于其理化性质不稳定、机械强度较差以及结合性能有限，难以广泛应用于层析分离。

近年来，Bio-Rad公司对羟磷灰石材料进行了改良，通过优化钙磷比例，制备出具有球形、多孔且性质稳定特点的陶瓷羟磷灰石颗粒。该材料中的带正电钙离子和带负电磷酸根离子可分别与蛋白质中的羧基和氨基发生相互作用。通过调节缓冲液的pH值，可使酸性或碱性氨基酸残基选择性地与树脂结合；再通过改变盐浓度，可实现蛋白质的洗脱与分离。

研究表明，该方法甚至能够有效分离等电点、分子量及疏水性均相近的蛋白质。